Получение ДНК-фрагментов желаемого размераСтраница 2
9. Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте их бромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.
10. Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В. Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10 мм Трис, рН 7,4, 1 мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.
11. Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.
Популярные статьи:
Результаты и их обсуждение
В процессе работы с образцами серых лесных легкосуглинистых почв (S101, S102 и S103) и чернозема выщелоченного (S41, S42, и S44) нами были получены данные по общей численности бактерий и по численности некоторых физиологических групп бакт ...
Искусственное сердце
Конструкция первого механического сердца была разработана еще в конце 1930-х гг. русским хирургом Владимиром Демиховым. Устройство это представляло собой насос, приводящийся в действие электромотором. Эксперименты показали перспективность ...
Годовой жизненный цикл
Из куриных перепел – единственная перелётная птица. Появляется на местах гнездований в числе последних перелётных видов, осенний отлёт происходит постепенно и малозаметен. [9]
Весной перепела появляются в последних числах марта, но брачн ...