Получение ДНК-фрагментов желаемого размераСтраница 2
9. Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте их бромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.
10. Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В. Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10 мм Трис, рН 7,4, 1 мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.
11. Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.
Популярные статьи:
Изменчивость и наследственность как предпосылки эволюции
Рассмотрение изменчивости и наследственности имеет огромное принципиальное значение. Можно ли объяснить эволюционный процесс только изменчивостью и наследственностью? Каковы данные для разрешения этого вопроса? ...
Биология как наука о живом
Нынешняя биология – прикладная физика, хотя ученые являются, несомненно, живыми людьми. Четыре Откровения указывают путь построения биологии как общения живых людей с разнообразными другими проявлениями жизни. При этом материя и разного р ...
Основные результаты
1. Рассмотрены основные методы регулирования интенсивности рыболовства. Показаны недостатки этих методов и возможные пути совершенствования.
2. Приведены особенности определения оптимальной интенсивности вылова и селективности лова с при ...