Основы клонирования, техника клонирования, клонирование ДНК

Страница 2

Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют. Рестрицируемая последовательность - мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т.е. читается одинаково в обоих направлениях. Две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами. Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой.

При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.

Этап 2. Встраивание генов в вектор

Плазмидная ДНК

Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают.

Фаговый вектор

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг λ. Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается.

Этап 3.Введение вектора в хозяйскую клетку

На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Escherichia coli- обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бактерии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен специальный мутант E.coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадает в окружающую среду вместе с чужеродными генами, которые он содержит.

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру E.coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране E.coli быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.

Этап 4. Клонирование ДНК

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинатную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 1012 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки E.coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашки Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформационных бактерий.

Популярные статьи:

Меристематическая культура.
Для меристематической культуры используют меристему - образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют кон ...

Как возникает материя
Эти сюжеты можно выбрать таким образом, что фюзоны будут существовать в двух состояниях: 1. Свободная игра туманных, возникающих и исчезающих душ. 2. Большое число индивидуализированных фюзонов с жесткими нормами общения. Здесь жесткос ...

Ареал обитания
В конце плейстоцена, от 100 до 10тыс. лет назад, львы жили по всему земному шару. Ареал их распространения охватывал всю Европу, Азию от Передней Азии до Индии и к северу до Сибири, практически всю Африку, а также оба Американских контине ...