Основы клонирования, техника клонирования, клонирование ДНК

Страница 2

Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют. Рестрицируемая последовательность - мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т.е. читается одинаково в обоих направлениях. Две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами. Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой.

При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.

Этап 2. Встраивание генов в вектор

Плазмидная ДНК

Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают.

Фаговый вектор

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг λ. Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается.

Этап 3.Введение вектора в хозяйскую клетку

На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Escherichia coli- обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бактерии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен специальный мутант E.coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадает в окружающую среду вместе с чужеродными генами, которые он содержит.

При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру E.coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шоку. В результате в клеточной мембране E.coli быстро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения новой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.

Этап 4. Клонирование ДНК

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинатную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 1012 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки E.coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашки Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести отбор трансформационных бактерий.

Популярные статьи:

История Харьковского зоопарка
В начале XIX века по инициативе видного общественного деятеля Василия Назаровича Каразина в Харькове был основан университет. Уже в 1817 году на плане Харькова появляется обозначение: «Земли, принадлежащие Харьковскому университету». Со в ...

Прооксидантные свойства флавоноидов
Наряду с антиоксидантными свойствами, флавоноиды способны проявлять прооксидантный эффект. Этому способствует способность флавонойдов окисляться – восстанавливаться, как получая электрон от органических продуктов, так и металлов переменно ...

Грибы. Fungi (лат.); Mices (греч.)
Распространение; повсеместно, споры грибов встречаются в любых экосистемах. Почвенные, водные, паразиты животных, человека, растений. Наибольшее кол-во грибов встречается в почве. Способны разлагать биополимеры, питаются продуктами их гид ...