Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка

Процессы формирования амилоидных фибрилл разными белками in vitro характеризуются разной скоростью (Kim et al., 2002; Stine et al., 2003; Hwang et al., 2004). Скорость фибриллообразования может зависеть от многих факторов: состава растворов, температуры, рН, и др. Но наибольшее влияние оказывает, скорее всего, тип вторичной структуры белка. Если белок содержит высокий процент α-спирали, то требуется трансформация типа "α-спираль – β-складчатость" (рис. 4). Так как белки семейства тайтина уже содержат β-складчатую структуру, то нет необходимости в изменении вторичной структуры. Скорость образования амилоидных структур белками семейства тайтина была продемонстрирована на примере Х-белка, так как он образует наиболее упорядоченные амилоидные структуры и методом электронной микроскопии можно визуально оценить, как происходит процесс фибриллообразования. Параллельно скорость образования амилоидных фибрилл Х-белком оценивалась по их связыванию с флуоресцентным красителем тиофлавином Т, который широко используется в качестве маркера амилоидов (LeVine, 1993).

В образцах белка происходило накопление их амилоидных структур, о чем свидетельствует возрастание флуоресцентного сигнала тиофлавина Т. Результаты представлены на рис. 20. Не происходит значительного увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с Х-белком в первые часы инкубации (1–4 часа), так как фибриллы еще не сформированы, а присутствуют аморфные агрегаты (рис. 20 А). При дальнейшей инкубации интенсивность флуоресценции тиофлавина Т возрастала (рис. 20 Г), что соответствовало образованию амилоидных фибрилл, среди которых наблюдаются и аморфные агрегаты (рис. 20 Б). После 22 часов диализа интенсивность флуоресценции красителя при связывании с фибриллами достигала плато флуоресцентной кривой, что согласуется с данными электронной микроскопии: отмечается присутствие хорошо сформированных спирально скрученных ленточных фибрилл Х-белка (рис. 20 В). Они наблюдаются и после 26 часов диализа.

Рис. 20. А – аморфные агрегаты Х-белка (4 часа диализа), Б – линейные фибриллы и аморфные агрегаты Х-белка (17 часов диализа), В – спирально скрученные ленточные фибриллы Х-белка (22 часа диализа), сформированные в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0. Негативное окрашивание 2% раствором уранилацетата. Шкала 100 нм. Г – скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка.

Для многих амилоидогенных белков также характерна временная зависимость образования амилоидных фибрилл. Например, мышечная ацилфосфатаза способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации в присутствии трифлуороэтанола при рН 5.5 и температуре 25˚С, и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999). Аβ(1-40)-пептид при рН 7.2, температуре 37˚С в присутствии 0.1% уксусной кислоты после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты и только после 48 часов – длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003). Эксперименты со многими белками показали, что перед образованием амилоидов in vitro структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа "α-спираль – β-складчатость", что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Согласно результатам нашего исследования, образование амилоидных фибрилл Х-белком происходит в мягких условиях (рН 7.0, температура 3–5°С, ионная сила, близкая к физиологической) и быстрее, чем в случае мышечной ацилфосфатазы человека и Аβ(1-40)-пептида. Следует также отметить, что в отличие от других белков, наличие 90% β-складчатой структуры у Х-белка способствует его быстрой агрегации в амилоидные фибриллы in vitro, что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo.

Популярные статьи:

Пипетки
Конечно, современные микропипетки совсем не похожи на те, которые употребляют в школьном химическом кабинете. Их устройство таково. Довольно объемистую, пластмассовую (снаружи) рукоятку пипетки удобно держать четырьмя пальцами руки, остав ...

Модельные микроэкосистемы
Небольшие автономные «миры» или микрокосмы, в бутылях или других сосудах могут имитировать в миниатюре природу различных экосистем. Эти небольшие «миры» можно рассматривать как Микроэкосистемы. Создание небольших, полностью закрытых систе ...

Восточные гости.
Из Египта кошки распространились по всему миру. Они быстро прижились в Азии, став неотъемлемым украшением дворцов и монастырей. Именно здесь много веков назад появились такие породы как сиамские и бирманские. Как и их египетские сестры ...