Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от массы белка, и от его суммарного электрического заряда, и от конфигурации, и от жесткости упаковки белковой глобулы. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием DDC-Na позволяет разделять белки, различающиеся между собой только по молекулярной массе. Для этого смесь белков в исходном препарате обрабатывают не менее, чем трехкратным избытком DDC-Na (по весу). За счет гидрофобных взаимодействий детергент одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг DDC-Na на 1 мг белка.

Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимый детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Благодаря электростатическому отталкиванию тесно расположенных отрицательно заряженных остатков серной кислоты, белковая цепь распрямляется и приобретает форму жесткой палочки с поперечником -1,6 m и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно — от молекулярной массы белка.

Одновременно с обработкой DDC-Na необходимо обеспечить возможность полного развертывания белковой цепи, а для этого — разорвать все ковалентные S-S связи внутри молекулы белка. С этой целью белок перед электрофорезом обрабатывают еще и высокой концентрацией (1%) (3-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофретическая подвижность, т. е. скорость миграции при напряженности поля 1 В/см, жесткого комплекса белок DDC-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением A-BIgM, где А и В — коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и' удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и «лидирующего красителя» — бромфенолового синего. Обозначим это отношение Rf. Такая замена отразится только на значении коэффициентов А и В, о которых нам известно только то, что они в данных условиях опыта одинаковы для всех белков. Измененные величины коэффициентов тоже будут постоянными величинами в данном опыте. Поэтому вместо их определения пользуются методом сравнения с известными по своей массе «маркерами». Одновременно с электрофорезом изучаемой смеси белков, отдельным треком на той же пластинке, т.е. в тождественных условиях эксперимента, разделяют смесь известных маркеров. С их помощью по точкам строят зависимость lgM=f(Rf), которая, естественно, оказывается прямолинейной. Опираясь на эту зависимость, можно графически, по измеренным величинам Rf определить значения lg М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Разумеется, вся предварительная обработка детергентом и Р-меркаптоэтанолом должна быть проведена строго одинаково для этого белка и всех маркеров.

Выбор буфера в этом варианте не играет роли, так как заряд белка определяется его комплексом с DDC-Na. Обычно используют нейтральный буфер, добавляя в него 0,1% DDC-Na, чтобы поддержать комплекс детергента с белками»

Для белков с молекулярной массой менее 12 тысяч дальтон определение М становится ненадежным. Для различных диапазонов масс белков рекомендуется использовать ПААГ различной пористости, согласно следующей таблице:

Диапазон М (тысяч дальтон) % ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Сам процесс электрофореза и окраски белков после его окончания производят как обычно, но DDC-Na от белка предпочтительно отмыть до окраски, вымачивая гель в 50% -ной ТХУ в течение ночи.

DDC-Na в комплексе с белком в некоторой мере препятствует окрашиванию (большой отрицательный заряд!).

Популярные статьи:

Человек прямоходящий (Homo erectus) (архантроп)
Homo erectus (люди прямоходящие) жили в период с 2 миллионов до 400 тысяч лет назад. По одной версии, они появились в Африке, но постепенно расселились по всему Старому Свету. Первые окаменелые останки Homo erectus были найдены Эженом Дю ...

Высаливание
Термином «высаливание» называют осаждение белков при высокой концентрации нейтральных солей. Этот метод является одним из старейших и наиболее широко применяемых 'при выделении или фракционировании белков. Среди применяемых солей предпочт ...

Взаимосвязь биосферы и ноосферы
Соотношение понятий биосферы и ноосферы было введено в научный контекст работами В.И.Вернадского, Т.де Шардена и Э. Леруа. Основоположниками постулировалось положение о «переходе» биосферы в ноосферу — на этом основании собственно и был в ...