ПЦР-реакция

Страница 2

На этапе 4 (при 72°) показаны два новых комплементарных синтеза. Тот, что идет по материнской нити, по-прежнему, пространственно не ограничен. А вот тот синтез, что начинается от правого праймера, сидящего на новосинтезированной копии окончится там, где в этой копии «спрятан» весь бывший «левый» праймер — ведь с него эта копия начиналась. В результате здесь впервые появляется выбранный для умножения участок ДНК, ограниченный двумя праймерами, включая и их самих. Это хорошо видно на этапе 5, когда после нагрева до 94° все двойные нити разошлись и на рисунке оказываются уже 4 одинарных нити, на которые, туда «где им положено» село 4 праймера (два «левых» и два «правых»). Этап 6 — синтез 4-х копий, начинающихся от этих праймеров. В трех случаях из четырех он ограничен длиной нужного отрезка ДНК. (Материнская нить здесь, как и всюду дальше копируется без ограничения справа.) Вместе с образованным на 4-м этапе и уже обрезанным с обеих сторон участком мы получаем 4 фрагмента исходной ДНК нужного размера. Это хорошо видно на этапе 7, где все четыре пары нитей ДНК разошлись и на них уже сидят 8 праймеров .

Если у читателя хватило терпения разобраться во всей этой «механике», то он согласится, что после синтеза на этапе 8 получится уже 11 отрезков ДНК нужной длины. Заметим попутно, что хотя мы рассматриваем «потомство» одной только «первой» материнской нити, среди полученных отрезков будут копии участков как «первой», так и «второй» материнской нити, поскольку мы уже не один раз вели комплементарный матричный синтез.

Проследим теперь закономерность, отраженную в цифрах, стоящих справа от рисунка, около изображений 3-го, 5-го, 7-го и 8-го этапов. Перед скобкой каждый раз стоит число одиночных нитей ДНК после нагревания до 94°. Легко заметить, что оно неизменно удваивается. Что и следовало ожидать, поскольку на каждом из предыдущих четных этапов все имеющиеся в наличии нити ДНК так или иначе копируются.

Но вот что может показаться неожиданным, и в чем состоит вся суть ПЦР-реакции. Число фрагментов нужного размера, указанное в скобках, нарастает несравненно быстрее: 0-1-4—11 штук. Так будет и далее. Каждый укороченный отрезок будет копироваться в том же размере. И число их будет непрерывно пополняться за счет не сразу укороченных отрезков ДНК. Через 30 циклов, подобных рассмотренным (а каждый цикл — это два этапа) количество нитей ДНК достигнет огромной цифры. Притом практически все они уже будут нужной длины — и выделение фрагмента, и его умножение состоялось! Вспомним, что у нас исходно было две нити. Таким образом написанное число надо удвоить.

Что это означает не в штуках, а в весовых единицах? Можно подсчитать, что если имелось изначально всего 10 молекул ДНК, длиной в 1000 пар оснований каждая, то в результате 30-ти циклов ПЦР-реакции должно получиться около 2-х микрограммов необходимого генетического материала. Для современных методов исследования это весьма значительное количество.

На самом деле в таких подсчетах конечный выход ДНК получится значительно завышенным, потому что Taq ДНК-полимера-за изнашивается, а после 30 циклов и вовсе перестает «работать». Но ведь можно внести новую порцию фермента и запустить еще 30 циклов. (Замечу попутно, что Taq ДНК-полимераза не очень «строга». После 30 циклов в среднем 1 нуклеотид из 400 оказывается включенным ошибочно.)

Разумеется, все эти циклы осуществляются не вручную, а в специальном приборе, от которого, впрочем, требуется не многое. Только очень быстро по обозначенной выше программе менять температуру весьма малого объема жидкости (защищенной от испарения тонким слоем минерального масла). Что же касается продолжительности 30-ти циклов, то даже, если учесть, что длительность синтеза приходится по указанной выше причине постепенно увеличивать от 3-х до 10-ти минут, то на один цикл прибор будет затрачивать в среднем 12 минут. А на 30 циклов — 6 часов.

От экспериментатора требуется только правильно составить рабочую смесь. Разумеется, если праймеры уже выбраны и синтезированы в достаточном количестве. Taq ДНК-полимераза и нуклеозидтрифосфаты имеются в продаже. Наработку большого количества определенного гена при помощи ПЦР-реакции часто называют «клонированном» этого гена. Описанную здесь ПЦР-реакцию с двумя праймерами иногда именуют «симметричной», в отличие от другой тоже ПЦР-реакции, но с одним начальным праймером, которую называют «ассиметричной».

ПЦР-реакцию надо включить в описанную там последовательность операций между получением кДНК и включением ДНК в плазмиду. В этом случае последовательность 21-го нуклео-тида для праймеров придется выбирать не свободно, а точно по концам гена, кодирующего наш белок. Эти оба конца можно установить, как это было описано с помощью ЧИП-метода. Для этого даже не надо знать всю аминокислотную последовательность белка, а только концевые участки — по 7 аминокислот с каждого конца. (Благо, как упоминалось, секвенирование белка теперь можно начинать с любого конца.) При синтезе концевого праймера надо только добавить концевой кодон УГА, который не транскрибируется в иРНК. Кроме того к «наружным» концам обоих праймеров имеет смысл уже на этом этапе добавить небольшие последовательности нуклеотидов, которые, не будучи комплементарны ни к какому участку гена, не будут и гибридизоваться. Но могут образовать два «липких» конца для последующего включения размноженной кДНК в разрезанные плазмиды. На рис. 35 эти дополнительные последовательности изображены в виде «хвостиков» у праймеров. Напомню, что эта размноженная кДНК нам потребовалась для того, чтобы добиться достаточно эффективного включения содержащих ее плазмид в бактерию, которая, размножаясь, будет нарабатывать в большом количестве нужный нам белок.

Популярные статьи:

Четвертичная структура и химическое сшивание
Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + -АТРазу, Na + /К +-АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционн ...

Анализ деятельности аппарата Гольджи в клетке. Анализ деятельности аппарата Гольджи в клетке
Лизосомы – это маленькие, окруженные одинарной мембраной пузырьки. Они отпочковываются от аппарата Гольджи и, возможно, от эндоплазматического ретикулума. Лизосомы содержат разнообразные ферменты, которые расщепляют крупные молекулы, в ч ...

Обработка результатов анализа
Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов "EuroBioWto Биоконтроль" и компьютерной програ ...