Загрузка геля. Ширина белковых полос

Страница 1

Очевидно, что распределение близко идущих зон белков будет тем успешнее, чем тоньше сами эти зоны. Поэтому при электрофорезе следует заботиться об уменьшении толщины белковых зон. Это накладывает ограничение на допустимую загрузку каждого трека пластины геля. В качестве ориентировочного максимума можно принять загрузку в 50 мкг белка в карман шириной в 5 мм для пластины толщиной в 1 мм. Идентификацию полос белка по их окраске можно проводить и при загрузках в 10 раз меньших. При перегрузке белковые полосы бывают резкими в передней своей части и размытыми сзади. В этом случае всегда следует считаться с возможностью выпадения белка в осадок в момент вступления его в гель, когда все макромолекулы стягиваются в тонкую полоску и локальная их концентрация сильно увеличивается.

В простом варианте электрофореза желательно наносить белковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота исходного слоя в кармане была не более, чем 2-3 мм. Исходя из цифры загрузки в 50 мкг можно подсчитать цифру исходной концентрации белкового препарата в 3-5 мг/мл.

Улучшения разрешения зон можно добиться путем принудительного концентрирования исходного препарата белка в тонкую полоску в момент его вхождения в гель. Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем область с повышенной напряженностью электрического поля, где белки мигрируют намного быстрее, чем в рабочем геле. На границе перехода из этой области в гель они будут стягиваться в тонкую полоску, так как находившиеся первоначально далеко позади молекулы белка догонят впереди идущих, замедливших свое движение при вступлении в рабочий гель. Повышения напряженности поля в области кармана, где находится исходный препарат очень просто достигнуть путем растворения этого препарата в рабочем буфере, но в 5—10 раз менее концентрированном (меньшей молярности), чем в геле и верхнем резервуаре. Благодаря уменьшению числа носителей заряда (например ионов С1) резко увеличивается локальное сопротивление слоя, содержащего препарат, а значит и напряжение на нем по сравнению с участком такой же длины в геле. Смешиванию с буфером верхнего резервуара в кармане помешает присутствие сахарозы в препарате.

Другим очень эффективным, но более сложным способом сужения полос уже в ходе их миграции является использование градиента пористости геля в направлении уменьшения среднего размера пор при продвижении к нижнему краю пластинки.

Предположим, что еще при формировании рабочего геля нам удалось создать такой градиент пористости. Сделать это можно с помощью относительно простого устройства, изображенного на рис. 4.

Рис.4

В левом из двух сообщающихся между собой (у самого дна) стаканов находится смесь жидких компонентов будущего геля низкой концентрации (например. Т=5%), а в правом— высокой концентрации (Т==20%). В первом из стаканов вращается магнитик мешалки (М). Из левого стакана жидкость поступает в перистальтический насос (Н), который медленно через трубочку (Тр) подает ее на дно формы для геля (Ф).

Популярные статьи:

Регенерация
Регенерация - явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференци ...

Обработка результатов анализа
Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов "EuroBioWto Биоконтроль" и компьютерной програ ...

Железы внутренней секреции
Железы внутренней секреции (эндокринные железы) не имеют выводных протоков, вырабатываемые ими вещества - гормоны поступают непосредственно в кровь. К эндокринным железам относятся: щитовидная и околощитовидная железы, гипофиз, эпифиз, н ...